amquar.达克珠单抗

Daclizumab（达珠单抗高产法）是一种人源化单克隆抗体，可与白细胞介素-2受体的α-亚基（CD25）结合，有利地调节多发性硬化症（MS）的免疫环境。

目录号

MA1018

纯度

> 97％的

规格

2毫克/毫升

• 生物活性

   

  Daclizumab（达珠单抗高产法）是一种人源化单克隆抗体，可与白细胞介素-2受体的α-亚基（CD25）结合，有利地调节多发性硬化症（MS）中的免疫环境。

  达克珠单抗与CD25的结合，Kd值为4.5nM。[1]

  Daclizuma在体外抑制IL-2依赖的KIT225 / K6细胞增殖，IC50为3.14nM [1]。

   

• 体外研究

   

• 体内研究

   

• 激酶实验

   

  使用表面等离子体共振进行等离子体共振结合表征[1]

   

  抗体结合特性werecharacterized以确定针对可溶性，重组人IL-2R的结合相互作用速率常数（ka和KD）和亲和常数（KD） α 使用Biacore技术（CD25）。使用伯胺共价偶联化学将每种抗体材料固定在芯片表面上。使用自动方法以不同浓度一式两份和参照表面注射重组CD25 2分钟。使用参考流动池和缓冲液空白校正结合数据。使用新制备的传感器表面复制测定，然后使用二价模型将结合数据与BIAevaluation软件拟合以获得用于动力学评估的平衡常数。

   

   

• 细胞实验

   

  细胞培养和效应细胞的分离[1]

   

  使用基于细胞的方法测定直接抑制IL-2依赖性高亲和力IL-2受体介导的增殖的相对抗体生物学效力，该方法评估滴定的抗体浓度对人白血病细胞系KIT225 / K6.28 PBMC增殖的影响。用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度分离并用作ADCC测定中的效应细胞。在另外的ADCC实验中，分别使用针对CD14和CD56的EasySepTM人CD34阳性选择试剂盒从PBMC培养物中除去单核细胞和NK细胞，并使用RobosepTM自动细胞分离系统的制造商方案。通过流式细胞术分析发现靶细胞消耗大于95％。所有血液均来自知情同意的健康志愿者，并且未对个体供体进行基因分型。

  ⁵¹ Cr标记靶细胞

  KIT225 / K6细胞在RPMI 1640*培养基（10％热灭活的胎牛血清加补充物）中生长。KIT225 / K6cells以2×10的终浓度悬浮在0.5毫升试验培养基（RPMI 1640,10％热inactivatedfetal牛serumplus补充剂）^7个细胞/ mL，并用500标记的 μ 次的⁵¹铬（50 μ 次/ 10 ⁶个细胞）在37温育^Ô在水浴中1个小时withoccasional混合℃。用12mL AssayMedium洗涤标记的细胞4次。使用Beckman Gamma5500B计数器靶标记的效率进行评价，并认为是可接受的，如果有在least20,000 CPM / 10的活动⁵细胞。标记的靶细胞在测定培养基中以2.5×10 ⁵细胞/ mL的细胞密度悬浮，或在CDC测定培养基中以5.0×10 ⁵细胞/ mL悬浮，视情况而定。

  补体依赖性细胞毒性测定

  将抗体在含有RPMI 1640,0.1％BSA和10mM HEPES的CDC AssayMedium中连续稀释。50 μ 洛夫⁵¹ Cr标记的靶细胞（25,000cells /孔）加入到wellsof amicrotiter U型底96孔板中，然后在50体积 μ 加入测试抗体的LOF系列稀释。25 μ 升8％的Triton X-100的and25 μ CDC分析培养基升加入到大释放孔中，并50 μ LOF CDC分析培养基加入到自发释放的孔（一式四份）。50 μ LOF 1/3稀释度的人血清池的溶液中加入于参考和testsample井。三分之一稀释的热灭活的（30分钟将50ml在56 ^öC）将人合并的血清加入补体非依赖性对照，大释放和自发释放孔中。通过鉴定特异性活性大的浓度而非特异性活性小化来预先建立宜的人合并血清浓度。测定板incubatedfor 2小时，在37 ^Ô在7.5％CO c ^ ₂培养箱然后纺at350 RCF在室温下5分钟。75的体积 μ LOF上清液转移托米尼管，和eachmini-管插入intoa闪烁小瓶中并计数1分钟在Beckman伽玛5500B计数器，或等同物。汇集的人血清使用静脉穿刺和标准技术从Quidel Corporation或健康志愿者获得。

  用于CDC活性的阳性对照抗体是人源化IgG1 / k抗体Hu＃4，其对于跨HLA-DR具有结合特异性。用于CDC和ADCC活性的阴性对照抗体具有对HSV病毒抗原具有结合特异性的人源化IgG1 / k抗体HuFd79。报告为百分比特异性裂解的值使用以下公式得出：特异性裂解百分比=（（抗体治疗计数每分钟（CPM） - 自发性CPM）/（大CPM - 自发性CPM））×100。

  抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定

  ⁵¹铬labeledKIT225 / K6细胞（12500个细胞/孔）预温育以1:1的fixedconcentration μ克/毫升的mAb（用于可变效应物与靶[E：T]比率格式）orvarious剂量（5,1，0.2 ，0.04％，0.008，和0.0016 μ克/毫升）的mAb（用于可变抗体浓度格式）处理30分钟，在4 ^Ó在100体积CIN V-bottom96-孔板 μ大号AssayMedium的。将对照细胞与单独的测定培养基（无mAb）一起温育，随后确定自发和大⁵¹ Cr释放，以及抗体非依赖性细胞介导的细胞毒性（AICC）。将PBMC（效应子）在分析培养基中，在单独的96孔聚丙烯板中连续稀释，产生6.25×10的浓度。^5个细胞/ 100 μ L，3.13x 10 ⁵细胞/ 100 μ L，1.56×10个⁵细胞/ 100 μ L，7.81x 10 ⁴细胞/ 100 μ L，3.91×10个⁴细胞/ 100 μ L. 100 μ LPER PBMC悬浮液的孔中转移到变量E：含有T比assayplate ⁵¹ Cr标记的KIT225 / K6 + 1 μ克/毫升的mAb，得到E：的T比50：1，25：1，12.5：1，6.25： 1和3.13：1。到variableantibody浓度测定板，将PBMC稀释至3.13£106细胞/ 100 μ Land100 μ每孔加入到试验孔中升。100 μ将单独的Assay培养基中的L（无效应物）加入到⁵¹ Cr标记的KIT225 / K6C mAb中，以确定⁵¹ Cr的自发和大释放。Theassay平板在50 RCF离心2分钟，并在37℃培养^Ô CIN 7.5％CO ₂培养箱中培养4个小时。4国税发小时培养结束前30分钟，25体积 μ tothe适当的对照孔中加入L 8％的TritonX-100的确定的大释放^51个 Crfrom靶细胞。ADCC活性的阳性对照抗体是对HLA-DR b链具有结合特异性的人源化IgG1 / k抗体Hu1D10。

  抑制IL-2依赖性增殖

  使用需要IL-2增殖的人KIT225 / K6细胞系测定Zenapax和DAC HYP的相对效力。在微量滴定组织培养板中在IL-2存在下针对单位体积的细胞滴定抗体，并使用530nm激发和590nm发射波长测定Alamarblue的减少。通过绘制相对荧光单位对log10浓度来确定阳性。产生S形曲线的值，并使用SoftMax Pro 4.3软件中的4参数拟合进行评估。

  

   

   

• 动物实验

   

  ATL的小鼠模型[2]

   

  ATL细胞群MET-1从患有急性ATL的患者的外周血中建立，并且通过NOD / SCID小鼠中的连续转移维持细胞。MET-1细胞具有通过荧光激活细胞分选分析阐明的暗色表型：CD3 ^dim，CD4 ^{+ /} - ，CD7 ^-，CD20 ^{- 和} CD25 ⁺。通过腹膜内注射1.5×10 ⁷ MET-1细胞到NOD / SCID小鼠中建立白血病模型。当这些小鼠的血清可溶性IL-2R- α （sIL- 2R- α ）水平超过1000pg / mL时，对这些小鼠进行治疗实验，这在肿瘤接种后约10至14天发生。

  大耐受剂量的定义

  在开始治疗研究之前，在NOD / SCID小鼠中测定大耐受剂量的缩酚酸肽。每天通过腹膜内施用每千克体重0.125,0.25,0.5,1.0和2.0mg缩酚酸肽的剂量，持续2周。2.0mg / kg组中的所有小鼠在第7天死亡，并且1.0mg / kg组中80％的小鼠在第14天死亡。在0.5,2.25和0.125mg / kg组中的小鼠在注射缩酚肽后6个月是stillalive 。因此，选择用于治疗试验的剂量为0.5mg / kgevery14天，持续14天; 这与其他研究人员在小鼠中使用的结果一致。

  Therapystudy

  在携带MET-1白血病的小鼠中进行治疗性研究，在小肿瘤负荷试验中血清替代肿瘤标志物sIL-2R- α 值为1000至10000μg / mL，在大肿瘤负荷试验中为10000至25000pg / mL 。在治疗试验中有5组。组1中，缩酚酸肽组，接收的0.5mg的缩酚酸肽/ kg体重2 weeks.Group 2每隔一天，免疫治疗（达珠单抗）基团，被赋予静脉injectionsof腹腔注射100 μ 克达珠单抗在第0，7，14，组3，联合治疗组，接受缩酚酸和达利珠单抗的联合治疗（给药方案如组1加组2）。第4组收到 200μ每周一次PBS，持续4周，并作为对照。第5组，没有肿瘤和没有治疗，作为NOD / SCID小鼠自然死亡的对照。在小肿瘤负荷治疗试验中每组有13只小鼠（sIL- 2R - α ，1000-10 000 pg / mL），在大肿瘤负荷中每组有8只小鼠（sIL-2R- α ，10 000- 25 000 pg / mL）。这些组被随机分配并且在实验开始时具有替代肿瘤标记物sIL-2R- α的可比较的平均水平。

  监测肿瘤生长

  的血清浓度国税发可溶性IL-2R-的测量 α 或可溶性 β 2 -微球蛋白（ β 2 μ ）用酶联免疫吸附测定进行。根据制造商的建议进行酶联免疫吸附测定。

  

   

  

   

• 不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表（数据来源于FDA指南）

   

   

  动物 A (mg/kg) = 动物 B (mg/kg)×动物 B的Km系数/动物 A的Km系数

   

  例如，已知某工具药用于小鼠的剂量为88 mg/kg , 则用于大鼠的剂量换算方法：将88 mg/kg 乘以小鼠的Km系数（3），再除以大鼠的Km系数（6），得到该药物用于大鼠的等效剂量44 mg/kg。

• 参考文献

  [1] Ganguly，B。; Balasa，B。; Efros，L。; 公主Hinton; Hartman，S。; Thakur，A。; 熊，JM; 施密特，B。; 罗宾逊，RR; Sornasse，T。; Vexler，V。; Sheridan，JP，与Zenapax相比，CD25结合抗体Daclizumab High-Yield Process具有*的糖基化模式和降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。MAbs 2016,8（7​​），1417-1424。
  [2] Chen，J。; 张，M。; Ju，W。; Waldmann，TA，使用缩酚肽及其与针对CD25的未修饰的达珠单抗的组合有效治疗成人T细胞白血病的鼠模型。Blood 2009,113（6），1287-93。

  分子式	分子量	CAS号	储存方式 -80 ℃长期储存。干冰运输
  溶剂（常温）	DMSO	水	乙醇

  体内溶解度

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